الاستعداد لمباراة CRMEFPréparation CRMEFمباراة CRMEFCRMEF SVT

الهندسة الوراثية (1): المبادئ والأدوات والاستنساخ الجيني


1. أهداف الدرس

في نهاية هذا الدرس، ينبغي أن تكون قادرًا على:

  • تعريف الهندسة الوراثية وتحديد الخصائص الطبيعية لـ ADN التي تجعلها ممكنة؛
  • وصف اشتغال أنزيمات الاقتطاع والتمييز بين النهايات اللاصقة والنهايات الحادّة، وتعليل أهمية الطابع المقلوب للموقع؛
  • تحديد دور كل أداة: أنزيم الاقتطاع، الليكاز، الناسخة العكسية، ADN-بوليمراز المقاوم للحرارة، المسبار؛
  • تعليل ضرورة استعمال ADN المتمم (ADNc) عند التعبير عن مورثة حقيقية النواة داخل بكتيريا؛
  • وصف مكوّنات الناقل البلازميدي وتحديد وظيفة كل مكوّن؛
  • ترتيب مراحل الاستنساخ الجيني وشرح مبدأ انتقاء البكتيريات المحوَّلة والمؤتلِفة؛
  • استثمار خريطة اقتطاع أو نتائج هجرة كهربائية لتحديد عدد مواقع الاقتطاع في جزيء خطي أو دائري.

استعرضت الدروس 16 إلى 23 المعلومة الوراثية من زاوية الفهم: بنيتها، تنظيمها، نسخها، قراءتها، ضبطها، وتغيّرها. أما هذا العنصر فيغيّر السؤال: كيف يُتدخَّل فيها مخبريًا؟ والملاحظ أن الهندسة الوراثية لم تخترع آليات جديدة؛ هي تستعمل أدوات مأخوذة من الكائنات الحية نفسها وخصائص فيزيائية-كيميائية سبق أن دُرست. لذلك يُقرأ هذا الدرس كتطبيق مباشر لما سبق، لا كموضوع منفصل.


2. المبدأ العام والأسس التي تجعله ممكنًا

أربع خصائص سبق دراستها هي التي تجعل هذا ممكنًا:

الخاصية المرجع ما تتيحه
تتام القواعد والتمسخ/إعادة التمسخ الدرس 16 التهجين الجزيئي، المسابر، تزاوج البادئات، لصق النهايات المتتامة
كونية الشفرة الوراثية الدرس 20 تعبير بكتيريا عن مورثة بشرية بشكل صحيح
وجود بلازميدات ذاتية المضاعفة الدرس 17 ناقل قادر على التكاثر داخل البكتيريا
أنزيمات طبيعية تشتغل على ADN الدرس 18 أدوات جاهزة للقطع واللحم والاصطناع

المشكلات العملية الأربع التي يجب حلّها: كيف نقطع ADN في مواضع محددة؟ كيف نلحم قطعتين من أصلين مختلفين؟ كيف نُدخل البناء إلى خلية؟ وكيف نميّز الخلايا التي استقبلته من التي لم تستقبله؟


3. الأدوات الجزيئية

3.1 أنزيمات الاقتطاع (enzymes de restriction)

  • أصله الطبيعي: نظام دفاعي بكتيري ضد ADN الغريب (العاثيات خصوصًا)؛ وتحمي البكتيريا جنيومها الخاص بـمثيلة مواقعها، فلا يقطعها أنزيمها.
  • الموقع مقلوب (palindromique): تسلسله يُقرأ بنفس الترتيب على السلسلتين في الاتجاه 5'→3'. هذه الخاصية هي التي تجعل القطع متماثلًا على السلسلتين.
نمط القطع مثال النتيجة
قطع متزحزح EcoRI: G↓AATTC نهايات لاصقة (extrémités cohésives): أطراف وحيدة السلسلة متتامة
قطع مستقيم SmaI: CCC↓GGG نهايات حادّة (extrémités franches)

3.2 باقي الأدوات

الأداة أصلها دورها في الهندسة الوراثية
ADN-ليكاز أنزيم المضاعفة (الدرس 18) لحم النهايات المتزاوجة بروابط فوسفوديستيرية، فيصبح البناء جزيئًا واحدًا
الناسخة العكسية (transcriptase inverse) فيروسات قهقرية اصطناع ADN انطلاقًا من ARN: ينتج ADN متمم (ADNc)
ADN-بوليمراز مقاوم للحرارة (Taq) بكتيريا الينابيع الحارة يتحمّل حرارة التمسخ، وهو أساس تقنية PCR (الدرس 25)
المسبار (sonde) قطعة ADN أو ARN موسومة يكشف عن تسلسل معيّن بالتهجين الجزيئي (الدرس 16)

3.3 لماذا ADN المتمم ضروري؟

عند نقل مورثة حقيقية النواة إلى بكتيريا للتعبير عنها، لا يمكن استعمال المورثة كما هي في الجنيوم:

  • المورثة حقيقية النواة مجزّأة بإكسونات وإنترونات (الدرس 17)؛
  • البكتيريا لا تملك جسيم اقتطاع ولا تعرف نضج ARN (الدرس 19)؛
  • فلو أُدخلت المورثة الجنيومية لتُرجمت الإنترونات مع الإكسونات، ولنتج بروتين غير وظيفي.

الحل: يُنطلق من ARN الرسول الناضج المستخرج من خلية تعبّر عن المورثة، وتُستعمل الناسخة العكسية لتحويله إلى ADNc: نسخة من المورثة بلا إنترونات، قابلة للترجمة الصحيحة في البكتيريا. هذا هو المبدأ المعتمد في إنتاج الأنسولين البشري.

صورة 1 — قيد الإعداد
وصف الوثيقة

خطاطة علمية تعليمية بأسلوب كتاب مدرسي، رسم مسطح (flat vector) بخطوط نظيفة، مقسّمة إلى لوحتين متجاورتين تعرضان نمطي القطع بأنزيمات الاقتطاع. اللوحة اليمنى معنونة «نهايات لاصقة — EcoRI»: جزء من لولب ADN مزدوج مرسوم كسلّم مسطح بسلسلتين رماديتين متضادتي الاتجاه مع تحديد 5' و3'، وفي وسطه تسلسل GAATTC مقابل CTTAAG مكتوبًا بحروف واضحة داخل إطار، وسهمان أحمران متزحزحان يبيّنان موضع القطع بين G و A على كل سلسلة، ثم أسفلها نتيجة القطع: قطعتان لكل منهما طرف وحيد السلسلة نافر يحمل الحروف AATT، مع سهمين متقابلين يبيّنان قابلية التزاوج بينهما. اللوحة اليسرى معنونة «نهايات حادّة — SmaI»: نفس التمثيل مع تسلسل CCCGGG وسهمين متقابلين في نفس المستوى، ونتيجة القطع قطعتان بطرفين مستويين بلا نتوءات. أسفل اللوحتين شريط يحمل عبارة «الموقع مقلوب: يُقرأ بنفس الترتيب على السلسلتين في الاتجاه 5'→3'». خلفية بيضاء نظيفة، تسميات بخط عربي واضح، رسم دقيق علميًا وواضح القراءة

صورة 2 — قيد الإعداد
وصف الوثيقة

خطاطة علمية تعليمية بأسلوب كتاب مدرسي، رسم مسطح (flat vector)، تعرض مبدأ الحصول على ADN المتمم في ثلاثة مستويات عمودية موصولة بأسهم. المستوى الأول: مورثة حقيقية النواة على شريط ADN أزرق فيها ثلاثة إكسونات داكنة وإنترونان رماديان فاتحان، معنونة «المورثة الجنيومية: مجزّأة». المستوى الثاني: ARN رسول ناضج برتقالي بإكسوناته الثلاثة متلاصقة، بقبعة خضراء وذيل عديد A، معنون «ARN رسول ناضج مستخرج من خلية معبِّرة». المستوى الثالث: شكل بيضاوي بنفسجي معنون «الناسخة العكسية» يعمل على الرسالة وينتج شريط ADN متمم أزرق متصل بلا إنترونات، معنون «ADNc: نسخة بلا إنترونات». على يسار اللوحة مساران متقابلان داخل بكتيريا مرسومة بشكل مبسّط: المسار العلوي يُدخل المورثة الجنيومية وينتهي ببروتين مشوّه مع علامة منع، والمسار السفلي يُدخل ADNc وينتهي ببروتين سليم مع علامة صواب، مع تسمية «البكتيريا لا تعرف الاقتطاع». خلفية بيضاء نظيفة، تسميات بخط عربي واضح، رسم علمي دقيق


4. الناقل (vecteur)

البلازميد هو الناقل النموذجي (الدرس 17)، ويجب أن يتوفر على ثلاثة مكوّنات على الأقل:

المكوّن وظيفته
موقع بدء المضاعفة (origine) يضمن تضاعف البلازميد باستقلال عن الصبغي البكتيري
موقع تعدد الاستنساخ تجمّع لمواقع اقتطاع فريدة تُدرَج فيها القطعة
مورثة انتقاء (marqueur) غالبًا مقاومة لمضاد حيوي، تسمح بعزل الخلايا التي استقبلت الناقل

ويُضاف إليها عادة مورثة كاشفة مثل lacZ تسمح بتمييز البلازميدات التي أُدرجت فيها القطعة فعلًا (انظر 5.5).

نواقل أخرى حسب حجم القطعة والغرض: العاثيات، الصبغيات الاصطناعية (BAC، YAC) للقطع الكبيرة، والنواقل الفيروسية في العلاج الجيني.


5. الاستنساخ الجيني: المراحل

5.1 الحصول على القطعة المراد إدخالها

بأحد ثلاثة طرق: قطع ADN جنيومي بأنزيم اقتطاع، أو تحويل ARN رسول إلى ADNc، أو تضخيم مباشر بـ PCR (الدرس 25).

5.2 فتح الناقل

يُقطع البلازميد بـنفس الأنزيم في موقع تعدد الاستنساخ، فتنشأ نهايات لاصقة متتامة مع نهايات القطعة.

5.3 اللحم وتكوين ADN المؤتلف

يُخلط الاثنان: تتزاوج النهايات المتتامة بروابط هيدروجينية، ثم يثبّت الليكاز الوصل بروابط فوسفوديستيرية.

5.4 التحويل (transformation)

تُجعل البكتيريات نفوذة (بمعالجة كيميائية أو كهربائية) فتدخلها البلازميدات. العملية ضعيفة المردود: أغلب البكتيريات لا تستقبل شيئًا، وبعضها يستقبل بلازميدًا أُعيد إغلاقه دون قطعة.

5.5 الانتقاء على مرحلتين

هذه المرحلة هي مفتاح التقنية كلها، لأن الناتج خليط.

السؤال الأداة القراءة
أي بكتيريا استقبلت بلازميدًا؟ وسط زرع يحتوي على المضاد الحيوي لا تنمو إلا البكتيريات الحاملة لمورثة المقاومة؛ الباقي يموت
أي بكتيريا استقبلت بلازميدًا يحمل القطعة؟ مورثة lacZ + كاشف لوني إدراج القطعة داخل lacZ يعطّلها ← مستعمرات بيضاء = مؤتلفة؛ المستعمرات الزرقاء = بلازميد بلا قطعة

5.6 التضخيم

تتكاثر البكتيريا المنتقاة فتُنتج مستنسخات (clones): ملايين النسخ المتطابقة من القطعة. ويمكن بعدها إما استخلاص القطعة نفسها، أو استثمار البروتين الذي تعبّر عنه البكتيريا.

صورة 3 — قيد الإعداد
وصف الوثيقة

خطاطة علمية تعليمية بأسلوب كتاب مدرسي، رسم مسطح (flat vector)، تعرض مراحل الاستنساخ الجيني في مسار دائري من ست محطات مرقّمة وموصولة بأسهم. المحطة 1: شريط ADN مصدر مع أنزيم اقتطاع ممثل بشكل مقص هندسي يقطع قطعة زرقاء ذات نهايات لاصقة. المحطة 2: بلازميد دائري أخضر عليه ثلاث مناطق ملوّنة معنونة: موقع بدء المضاعفة، مورثة مقاومة مضاد حيوي، ومورثة lacZ يوجد داخلها موقع تعدد الاستنساخ، ونفس المقص يفتحه في ذلك الموقع. المحطة 3: التحام القطعة الزرقاء بالبلازميد المفتوح مع شكل صغير معنون «ليكاز» عند نقطتي الوصل، والناتج بلازميد دائري مؤتلف. المحطة 4: بكتيريا مرسومة بشكل مبسّط يدخلها البلازميد، معنونة «تحويل». المحطة 5: علبة بتري مرسومة من الأعلى تحتوي على مستعمرات: مستعمرات زرقاء ومستعمرات بيضاء، مع تسمية «الوسط يحتوي على المضاد الحيوي» وسهم يشير إلى المستعمرات البيضاء بعبارة «مؤتلفة». المحطة 6: أنبوب زرع فيه بكتيريات متكاثرة مع سهمين: أحدهما نحو قطعة ADN مضخّمة والآخر نحو بروتين منتَج. خلفية بيضاء نظيفة، تسميات بخط عربي واضح، رسم علمي دقيق ومقروء


6. تمرين محلول: استثمار خريطة اقتطاع

المعطيات: تُعالَج قطعة من ADN بأنزيم الاقتطاع EcoRI، ثم تُخضع النواتج لهجرة كهربائية. يُلاحَظ ثلاثة أشرطة بأطوال 3500 و1500 و1000 زوج قواعد.

السؤال 1: ما طول القطعة الأصلية؟ وكم موقع اقتطاع تتضمن، إذا كانت خطية؟ وإذا كانت دائرية؟

الحل:

  • الطول الإجمالي = 3500 + 1500 + 1000 = 6000 زوج قواعد (مجموع الأجزاء يساوي الجزيء الأصلي).
  • إذا كانت خطية: كل قطع يزيد عدد الأجزاء بواحد، فعدد الأجزاء = عدد المواقع + 1، ومنه: 3 = n + 1 ← موقعان اثنان.
  • إذا كانت دائرية: القطع الأول يفتح الحلقة دون أن يزيد العدد، فعدد الأجزاء = عدد المواقع، ومنه: 3 = n ← ثلاثة مواقع.

السؤال 2: لماذا يُقطع الناقل والقطعة المراد إدخالها بنفس الأنزيم؟

الحل: لأن النهايات اللاصقة الناتجة عن أنزيم معيّن متتامة فيما بينها حصريًا. استعمال أنزيمين مختلفين يعطي نهايات غير متتامة لا تتزاوج، فيتعذّر على الليكاز أن يلحم البناء. (الاستثناء أن يكون الأنزيمان يولّدان نفس النتوء، وهي حالة خاصة.)

السؤال 3: بعد التحويل، حصلنا على مستعمرات زرقاء وأخرى بيضاء على وسط يحتوي المضاد الحيوي. ماذا نستنتج عن كل صنف؟

الحل: نموّ المستعمرتين معًا يعني أن كلتيهما استقبلت بلازميدًا (وإلا لماتت في وجود المضاد الحيوي). والفارق بينهما في lacZ: المستعمرات البيضاء تحمل بلازميدات أُدرجت فيها القطعة فعطّلتها، وهي المؤتلفة المطلوبة؛ أما الزرقاء فتحمل بلازميدات أُعيد إغلاقها دون إدراج.


7. أخطاء شائعة وفخاخ الامتحان

الخطأ التصويب
«أنزيم الاقتطاع أنزيم اصطناعي» أنزيم بكتيري طبيعي، دوره الأصلي الدفاع ضد ADN الغريب
«أنزيم الاقتطاع يقطع في أي موضع» يتعرّف على تسلسل نوعي مقلوب ولا يقطع خارجه
«القطع يعطي دائمًا نهايات لاصقة» حسب الأنزيم: قطع متزحزح ← لاصقة؛ قطع مستقيم ← حادّة
«يمكن استعمال أنزيمين مختلفين للناقل والقطعة» النهايات لن تكون متتامة، فلا يتم اللحم
«الليكاز هو الذي يقطع» الليكاز يلحم؛ القطع بأنزيم الاقتطاع
«تُدخَل المورثة الجنيومية مباشرة في البكتيريا للتعبير عنها» يجب استعمال ADNc، لأن البكتيريا لا تستأصل الإنترونات
«الناسخة العكسية تصطنع ARN من ADN» العكس: ADN انطلاقًا من ARN
«كل البكتيريات تستقبل البلازميد» مردود التحويل ضعيف؛ ومن هنا ضرورة الانتقاء
«مورثة المقاومة تميّز البكتيريا المؤتلفة» تميّز فقط التي استقبلت بلازميدًا؛ التمييز الثاني يتم بـ lacZ
«المستعمرات الزرقاء هي المؤتلفة» العكس: البيضاء هي المؤتلفة، لأن الإدراج عطّل lacZ
«الاستنساخ الجيني يعني استنساخ كائن حي» هنا استنساخ قطعة ADN (نسخ متطابقة)، وهو غير الاستنساخ التكاثري
«قطع جزيء دائري في 3 مواقع يعطي 4 أجزاء» يعطي 3؛ قاعدة «+1» خاصة بالجزيء الخطي

8. معجم المصطلحات

بالعربية بالفرنسية
الهندسة الوراثية Génie génétique
أنزيم اقتطاع Enzyme de restriction
موقع مقلوب Site palindromique
نهايات لاصقة / حادّة Extrémités cohésives / franches
ADN-ليكاز ADN-ligase
الناسخة العكسية Transcriptase inverse
ADN متمم ADN complémentaire (ADNc)
مسبار Sonde
ناقل Vecteur
موقع تعدد الاستنساخ Site multiple de clonage
مورثة انتقاء Gène marqueur de sélection
ADN مؤتلف ADN recombinant
تحويل Transformation
مستنسخ Clone
خريطة اقتطاع Carte de restriction

9. خلاصة

  • الهندسة الوراثية لا تخترع آليات جديدة: تستثمر تتام القواعد، كونية الشفرة، البلازميدات، وأنزيمات طبيعية.
  • أنزيمات الاقتطاع بكتيرية الأصل، تتعرّف على مواقع مقلوبة قصيرة، وتعطي إما نهايات لاصقة (قطع متزحزح) أو حادّة (قطع مستقيم)؛ والنهايات اللاصقة الناتجة عن نفس الأنزيم متتامة، ومن ثم قاعدة استعمال نفس الأنزيم للناقل وللقطعة.
  • الأدوات الأخرى: الليكاز (اللحم)، الناسخة العكسية (ARN ← ADNc)، البوليمراز المقاوم للحرارة (PCR)، المسابر (الكشف بالتهجين).
  • ADNc ضروري للتعبير عن مورثة حقيقية النواة في بكتيريا، لأن هذه الأخيرة لا تعرف الاقتطاع.
  • الناقل البلازميدي يتضمن: موقع بدء مضاعفة، موقع تعدد استنساخ، ومورثة انتقاء، وغالبًا مورثة كاشفة.
  • مراحل الاستنساخ: الحصول على القطعة ← فتح الناقل بنفس الأنزيم ← اللحم بالليكاز فينتج ADN مؤتلف ← التحويل ← انتقاء على مرحلتين (المضاد الحيوي ثم lacZ: المستعمرات البيضاء مؤتلفة) ← التضخيم بتكاثر البكتيريا.
  • قاعدة خريطة الاقتطاع: عدد الأجزاء = عدد المواقع +1 في الجزيء الخطي، وعدد المواقع في الجزيء الدائري.

الدرس الموالي

الدرس 25: الهندسة الوراثية (2) — التقنيات والتطبيقات. بعد الأدوات ومبدأ الاستنساخ الجيني (هذا الدرس)، يتناول الدرس الموالي التقنيات المشتقة منها وتطبيقاتها: تفاعل البوليمراز المتسلسل PCR، الهجرة الكهربائية والبصمة الوراثية، تحديد التسلسل، ثم التطبيقات الطبية والفلاحية (الأنسولين البشري، الكائنات المعدَّلة وراثيًا، التشخيص الجيني، مبادئ العلاج الجيني).

Le génie génétique (1) : principes, outils et clonage génique


1. Objectifs de la leçon

À la fin de cette leçon, vous devriez être capable de :

  • définir le génie génétique et identifier les propriétés naturelles de l'ADN qui le rendent possible ;
  • décrire le fonctionnement des enzymes de restriction, distinguer extrémités cohésives et extrémités franches, et justifier l'importance du caractère palindromique du site ;
  • préciser le rôle de chaque outil : enzyme de restriction, ligase, transcriptase inverse, ADN-polymérase thermorésistante, sonde ;
  • justifier la nécessité d'utiliser un ADN complémentaire (ADNc) pour exprimer un gène eucaryote dans une bactérie ;
  • décrire les composants d'un vecteur plasmidique et la fonction de chacun ;
  • ordonner les étapes du clonage génique et expliquer le principe de la sélection des bactéries transformées puis recombinantes ;
  • exploiter une carte de restriction ou des résultats d'électrophorèse pour déterminer le nombre de sites de restriction d'une molécule linéaire ou circulaire.

Les leçons 16 à 23 ont abordé l'information génétique sous l'angle de la compréhension : sa structure, son organisation, sa copie, sa lecture, sa régulation et sa variation. Cet élément change la question : comment intervenir sur elle au laboratoire ? Or le génie génétique n'a inventé aucun mécanisme nouveau ; il utilise des outils empruntés aux êtres vivants eux-mêmes et des propriétés physico-chimiques déjà étudiées. Cette leçon se lit donc comme une application directe de ce qui précède, et non comme un sujet distinct.


2. Le principe général et les fondements qui le rendent possible

Quatre propriétés déjà étudiées le rendent possible :

Propriété Référence Ce qu'elle autorise
Complémentarité des bases et dénaturation/renaturation Leçon 16 Hybridation moléculaire, sondes, hybridation des amorces, appariement des extrémités
Universalité du code génétique Leçon 20 Expression correcte d'un gène humain par une bactérie
Existence de plasmides à réplication autonome Leçon 17 Un vecteur capable de se multiplier dans la bactérie
Enzymes naturelles agissant sur l'ADN Leçon 18 Des outils tout prêts pour couper, souder et synthétiser

Les quatre problèmes pratiques à résoudre : comment couper l'ADN à des endroits précis ? comment souder deux fragments d'origines différentes ? comment introduire la construction dans une cellule ? et comment distinguer les cellules qui l'ont reçue de celles qui ne l'ont pas reçue ?


3. Les outils moléculaires

3.1 Les enzymes de restriction

  • son origine naturelle : un système de défense bactérien contre l'ADN étranger (celui des phages en particulier) ; la bactérie protège son propre génome en méthylant ses sites, que son enzyme ne coupe donc pas.
  • le site est palindromique : sa séquence se lit dans le même ordre sur les deux brins dans le sens 5'→3'. C'est cette propriété qui rend la coupure symétrique sur les deux brins.
Type de coupure Exemple Résultat
Coupure décalée EcoRI : G↓AATTC Extrémités cohésives : bouts simple brin complémentaires
Coupure droite SmaI : CCC↓GGG Extrémités franches

3.2 Les autres outils

Outil Origine Rôle en génie génétique
ADN-ligase Enzyme de la réplication (leçon 18) Soude les extrémités appariées par des liaisons phosphodiester, faisant de la construction une seule molécule
Transcriptase inverse Virus à ARN (rétrovirus) Synthétise de l'ADN à partir d'un ARN : elle produit un ADN complémentaire (ADNc)
ADN-polymérase thermorésistante (Taq) Bactéries des sources chaudes Supporte la température de dénaturation : c'est la base de la PCR (leçon 25)
Sonde Fragment d'ADN ou d'ARN marqué Détecte une séquence donnée par hybridation moléculaire (leçon 16)

3.3 Pourquoi l'ADN complémentaire est-il indispensable ?

Pour transférer un gène eucaryote dans une bactérie afin de l'y exprimer, on ne peut pas utiliser le gène tel qu'il existe dans le génome :

  • le gène eucaryote est morcelé en exons et introns (leçon 17) ;
  • la bactérie ne possède pas de spliceosome et ignore la maturation des ARN (leçon 19) ;
  • si l'on introduisait le gène génomique, les introns seraient traduits avec les exons et la protéine obtenue serait non fonctionnelle.

La solution : partir de l'ARN messager mature extrait d'une cellule exprimant le gène, et utiliser la transcriptase inverse pour le convertir en ADNc : une copie du gène sans introns, correctement traduisible par la bactérie. C'est le principe retenu pour la production de l'insuline humaine.

Image 1 — en préparation
Description

Schéma scientifique pédagogique de style manuel scolaire, illustration vectorielle plate à traits nets, organisée en deux panneaux juxtaposés présentant les deux types de coupure par les enzymes de restriction. Panneau de gauche intitulé « extrémités cohésives — EcoRI » : une portion de double hélice d'ADN dessinée en échelle aplatie à deux brins gris antiparallèles avec repérage des extrémités 5' et 3', portant en son milieu la séquence GAATTC face à CTTAAG inscrite en lettres nettes dans un cadre, et deux flèches rouges décalées indiquant le point de coupure entre le G et le A sur chaque brin ; en dessous, le résultat : deux fragments munis chacun d'un bout simple brin saillant portant les lettres AATT, avec deux flèches en vis-à-vis montrant leur capacité d'appariement. Panneau de droite intitulé « extrémités franches — SmaI » : même représentation avec la séquence CCCGGG et deux flèches face à face au même niveau, le résultat étant deux fragments à bords droits sans saillie. Sous les deux panneaux, un bandeau portant la mention « site palindromique : même lecture sur les deux brins dans le sens 5'→3' ». Fond blanc épuré, annotations en français, rendu scientifiquement précis et lisible

Image 2 — en préparation
Description

Schéma scientifique pédagogique de style manuel scolaire, illustration vectorielle plate, présentant le principe d'obtention de l'ADN complémentaire en trois niveaux verticaux reliés par des flèches. Premier niveau : un gène eucaryote sur un ruban d'ADN bleu comportant trois exons foncés et deux introns gris clair, légendé « gène génomique : morcelé ». Deuxième niveau : un ARN messager mature orange à trois exons contigus, muni d'une coiffe verte et d'une queue poly-A, légendé « ARN messager mature extrait d'une cellule exprimant le gène ». Troisième niveau : une forme ovale violette légendée « transcriptase inverse » agissant sur le messager et produisant un brin d'ADN complémentaire bleu continu, sans introns, légendé « ADNc : copie sans introns ». Sur le côté de la planche, deux trajets opposés à l'intérieur d'une bactérie schématisée : le trajet supérieur introduit le gène génomique et aboutit à une protéine déformée accompagnée d'un symbole d'interdiction, le trajet inférieur introduit l'ADNc et aboutit à une protéine correcte accompagnée d'un symbole de validation, avec la mention « la bactérie ne sait pas épisser ». Fond blanc épuré, annotations en français, rendu scientifique précis


4. Le vecteur

Le plasmide en est le modèle (leçon 17) ; il doit comporter au moins trois éléments :

Élément Fonction
Origine de réplication Assure la réplication du plasmide indépendamment du chromosome bactérien
Site multiple de clonage Regroupement de sites de restriction uniques où le fragment est inséré
Gène marqueur de sélection Le plus souvent une résistance à un antibiotique, permettant d'isoler les cellules ayant reçu le vecteur

S'y ajoute généralement un gène rapporteur tel que lacZ, qui permet de distinguer les plasmides ayant réellement reçu le fragment (voir 5.5).

D'autres vecteurs existent selon la taille du fragment et l'objectif : les phages, les chromosomes artificiels (BAC, YAC) pour les grands fragments, et les vecteurs viraux en thérapie génique.


5. Le clonage génique : les étapes

5.1 Obtention du fragment à insérer

Par l'une de trois voies : coupure d'un ADN génomique par une enzyme de restriction, conversion d'un ARN messager en ADNc, ou amplification directe par PCR (leçon 25).

5.2 Ouverture du vecteur

Le plasmide est coupé par la même enzyme au niveau du site multiple de clonage, ce qui crée des extrémités cohésives complémentaires de celles du fragment.

5.3 Ligature et formation de l'ADN recombinant

Les deux sont mis en présence : les extrémités complémentaires s'apparient par liaisons hydrogène, puis la ligase consolide la jonction par des liaisons phosphodiester.

5.4 La transformation

Les bactéries sont rendues perméables (par traitement chimique ou électrique) et les plasmides y pénètrent. Le rendement est faible : la plupart des bactéries ne reçoivent rien, et certaines reçoivent un plasmide refermé sans fragment.

5.5 Une sélection en deux temps

Cette étape est la clé de toute la technique, puisque le produit obtenu est un mélange.

Question Outil Lecture
Quelles bactéries ont reçu un plasmide ? Milieu de culture additionné de l'antibiotique Seules les bactéries porteuses du gène de résistance se développent ; les autres meurent
Quelles bactéries ont reçu un plasmide porteur du fragment ? Gène lacZ + révélateur coloré L'insertion du fragment dans lacZ l'inactive → colonies blanches = recombinantes ; colonies bleues = plasmide sans fragment

5.6 L'amplification

Les bactéries sélectionnées se multiplient et produisent des clones : des millions de copies identiques du fragment. On peut ensuite soit extraire le fragment lui-même, soit exploiter la protéine exprimée par les bactéries.

Image 3 — en préparation
Description

Schéma scientifique pédagogique de style manuel scolaire, illustration vectorielle plate, présentant les étapes du clonage génique selon un parcours circulaire de six stations numérotées et reliées par des flèches. Station 1 : un ruban d'ADN source avec une enzyme de restriction figurée par des ciseaux géométriques découpant un fragment bleu à extrémités cohésives. Station 2 : un plasmide circulaire vert portant trois régions colorées annotées : origine de réplication, gène de résistance à un antibiotique, et gène lacZ contenant le site multiple de clonage, les mêmes ciseaux l'ouvrant à ce site. Station 3 : insertion du fragment bleu dans le plasmide ouvert, avec une petite forme annotée « ligase » aux deux points de jonction, le produit étant un plasmide recombinant circulaire. Station 4 : une bactérie schématisée dans laquelle pénètre le plasmide, légendée « transformation ». Station 5 : une boîte de Petri vue de dessus portant des colonies bleues et des colonies blanches, avec la mention « milieu additionné d'antibiotique » et une flèche désignant les colonies blanches par le mot « recombinantes ». Station 6 : un tube de culture où les bactéries se multiplient, avec deux flèches : l'une vers un fragment d'ADN amplifié, l'autre vers une protéine produite. Fond blanc épuré, annotations en français, rendu scientifique précis et lisible


6. Exercice résolu : exploitation d'une carte de restriction

Données : un fragment d'ADN est traité par l'enzyme de restriction EcoRI, puis les produits sont soumis à une électrophorèse. On observe trois bandes de 3 500, 1 500 et 1 000 paires de bases.

Question 1 : quelle est la longueur du fragment initial ? Combien de sites de restriction comporte-t-il s'il est linéaire ? s'il est circulaire ?

Correction :

  • longueur totale = 3 500 + 1 500 + 1 000 = 6 000 paires de bases (la somme des fragments égale la molécule initiale).
  • s'il est linéaire : chaque coupure augmente le nombre de fragments d'une unité, donc nombre de fragments = nombre de sites + 1, d'où 3 = n + 1 → deux sites.
  • s'il est circulaire : la première coupure ouvre l'anneau sans augmenter le nombre de fragments, donc nombre de fragments = nombre de sites, d'où 3 = n → trois sites.

Question 2 : pourquoi coupe-t-on le vecteur et le fragment à insérer avec la même enzyme ?

Correction : parce que les extrémités cohésives produites par une enzyme donnée ne sont complémentaires qu'entre elles. Deux enzymes différentes donnent des extrémités non complémentaires qui ne s'apparient pas, et la ligase ne peut alors pas souder la construction. (L'exception concerne deux enzymes générant la même saillie, cas particulier.)

Question 3 : après transformation, on obtient des colonies bleues et des colonies blanches sur un milieu additionné d'antibiotique. Que conclure pour chaque catégorie ?

Correction : la croissance des deux catégories montre que toutes deux ont reçu un plasmide (sans quoi elles auraient été éliminées par l'antibiotique). La différence porte sur lacZ : les colonies blanches portent des plasmides dans lesquels le fragment a été inséré, ce qui a inactivé le gène — ce sont les recombinantes recherchées ; les bleues portent des plasmides refermés sans insertion.


7. Erreurs fréquentes et pièges d'examen

Erreur Correction
« L'enzyme de restriction est une enzyme artificielle » C'est une enzyme bactérienne naturelle, dont le rôle initial est la défense contre l'ADN étranger
« L'enzyme de restriction coupe n'importe où » Elle reconnaît une séquence palindromique spécifique et ne coupe pas ailleurs
« La coupure donne toujours des extrémités cohésives » Cela dépend de l'enzyme : coupure décalée → cohésives ; coupure droite → franches
« On peut utiliser deux enzymes différentes pour le vecteur et le fragment » Les extrémités ne seraient pas complémentaires et la ligature serait impossible
« C'est la ligase qui coupe » La ligase soude ; la coupure est le fait de l'enzyme de restriction
« On introduit directement le gène génomique dans la bactérie pour l'exprimer » Il faut un ADNc, la bactérie ne sachant pas exciser les introns
« La transcriptase inverse synthétise de l'ARN à partir d'ADN » L'inverse : de l'ADN à partir d'un ARN
« Toutes les bactéries reçoivent le plasmide » Le rendement de la transformation est faible, d'où la nécessité de la sélection
« Le gène de résistance identifie les bactéries recombinantes » Il identifie seulement celles ayant reçu un plasmide ; la seconde distinction se fait par lacZ
« Les colonies bleues sont les recombinantes » L'inverse : les blanches le sont, l'insertion ayant inactivé lacZ
« Le clonage génique signifie cloner un être vivant » Il s'agit ici du clonage d'un fragment d'ADN (copies identiques), à ne pas confondre avec le clonage reproductif
« Couper une molécule circulaire en 3 sites donne 4 fragments » Elle en donne 3 ; la règle du « +1 » ne vaut que pour une molécule linéaire

8. Lexique

Français Arabe
Génie génétique الهندسة الوراثية
Enzyme de restriction أنزيم اقتطاع
Site palindromique موقع مقلوب
Extrémités cohésives / franches نهايات لاصقة / حادّة
ADN-ligase ADN-ليكاز
Transcriptase inverse الناسخة العكسية
ADN complémentaire (ADNc) ADN متمم
Sonde مسبار
Vecteur ناقل
Site multiple de clonage موقع تعدد الاستنساخ
Gène marqueur de sélection مورثة انتقاء
ADN recombinant ADN مؤتلف
Transformation تحويل
Clone مستنسخ
Carte de restriction خريطة اقتطاع

9. Bilan

  • Le génie génétique n'invente pas de mécanismes : il exploite la complémentarité des bases, l'universalité du code, les plasmides et des enzymes naturelles.
  • Les enzymes de restriction, d'origine bactérienne, reconnaissent de courts sites palindromiques et donnent soit des extrémités cohésives (coupure décalée), soit des extrémités franches (coupure droite) ; les extrémités cohésives issues d'une même enzyme étant complémentaires, d'où la règle d'utiliser la même enzyme pour le vecteur et le fragment.
  • Autres outils : la ligase (soudure), la transcriptase inverse (ARN → ADNc), la polymérase thermorésistante (PCR) et les sondes (détection par hybridation).
  • L'ADNc est indispensable pour exprimer un gène eucaryote dans une bactérie, celle-ci ignorant l'épissage.
  • Le vecteur plasmidique comporte : une origine de réplication, un site multiple de clonage et un gène marqueur de sélection, auxquels s'ajoute souvent un gène rapporteur.
  • Étapes du clonage : obtention du fragment → ouverture du vecteur par la même enzyme → ligature donnant un ADN recombinant → transformation → sélection en deux temps (antibiotique puis lacZ : colonies blanches recombinantes) → amplification par multiplication bactérienne.
  • Règle des cartes de restriction : nombre de fragments = nombre de sites + 1 pour une molécule linéaire, et = nombre de sites pour une molécule circulaire.

Leçon suivante

Leçon 25 : Le génie génétique (2) — techniques et applications. Après les outils et le principe du clonage génique (présente leçon), la leçon suivante aborde les techniques qui en dérivent et leurs applications : l'amplification en chaîne par polymérase (PCR), l'électrophorèse et l'empreinte génétique, le séquençage, puis les applications médicales et agricoles (insuline humaine, organismes génétiquement modifiés, diagnostic génétique et principes de la thérapie génique).